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公司公告

无菌均质器基因的质粒自身环化

! ’#什么是生长因子?其主要作用方式有哪些? (汪 !渊) 第十七章 !基因技术 !!本章教学要求 !! 示质粒上插入了外源基因,这些外源基因不一定就是目的基因。基因工 程菌的筛选(%("’’$)$<)和鉴定( )+’$!)&)(#!)*$)即是在这些菌落中筛选出含有目的基因的菌落,并鉴定其正 确性。 --345重组体和质粒自身环化的鉴别:带有双抗生素标记的质粒自身环化在两种抗生素培养基上都能 生长, 345重组体只能在其中一种抗生素培养基上生长。带有 =#(>无菌均质器基因的质粒自身环化在 ? <#0培养 基上经异丙基硫代半乳糖苷( )%*/"*/@0 !A)*<#0#(!*%)+’,BCDE)诱导生成蓝色的菌落, 345重组体长成白色 的菌落。 --基因工程菌的筛选一般选用菌落或噬菌斑原位杂交方法( (*0*$@ G /0#H,’ )$ %)!, A@I")+)J#!)*$)。首先将在琼脂平板上生长的重组菌落或 噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上,以 4#KL裂解菌落,并使 345变性,固 定到膜上,用特异的 345或 M45探针与之进行分子杂交。挑选含有 目的基因的克隆菌(图 F; 8)。 --外源基因获得表达的基因工程菌也可以用免疫学的方法筛选。操 作过程与菌落原位杂交基本相似。硝酸纤维素膜上的菌落裂解后,固 定蛋白质并用相应的抗体检测菌落。 --对筛选出的基因工程菌还需要进行结构分析鉴定。提取基因工程 菌中的质粒,用限制酶切,经凝胶电泳检测插入片段的大小,作物理图 谱。更可靠的方法是作 345的序列分析。 --(五)外源基因的表达 --载体依据功能的不同可分为克隆载体和表达载体两类。

 

克隆载体 以复制基因,增加基因的拷贝数为目的。只需要具备复制子、多克隆位 点和筛选标志。表达载体不仅要复制外源基因,还要表达外源基因。除需具备克隆载体的条件外,还要有 基因表达的调控序列。 --原核细胞中基因表达的调控元件有以下几种: --(F)启动子 -启动子是 345上转录起始位点上游的一段序列,是 M45聚合酶的识别和结合位点(见 第十三章)。原核细胞基因工程采用的强启动子包括色氨酸操纵子启动子, !噬菌体左向和右向启动子, D; 噬菌体的启动子等。 --(7)N3序列 -N3序列是 .M45翻译起始点上游的一段序列,该序列和核糖体小亚基上 FO N "M45 的 PQ端的碱基互补,是核糖体的结合位点(参见第十四章),N3序列和翻译起始点之间的距离影响翻译的 效率。 --(P)终止子 -利用强启动子表达外源基因时,在外源基因的下游必须加入不依赖 !因子的转录终止 图 F; 8-菌落原位杂交 第十七章 ,基因技术#"! 子,以防转录的“通读”并提高质粒的稳定性。终止子是 !"# $%端的一段序列,具有终止转录的功能。终 止子转录出来的 &’"#能形成茎环结构,并紧接着多聚 (,形成转录终止信号。 ,,用于原核细胞基因工程的表达载体,根据基因表达的蛋白质 是否与细菌蛋白融合型分为非融合蛋白表达载体和融合型蛋白 表达载体。非融合蛋白载体表达的产物,结构和生物学功能都接 近天然产物,缺点是易被细菌蛋白酶降解。融合蛋白载体表达的 蛋白质不被细菌蛋白酶降解,可用针对原核蛋白的亲和层析纯化 融合蛋白。但纯化后还需要采取措施从融合蛋白上切下所需要 的蛋白质或多肽(图 )* +)。 ,,不论是融合型表达载体还是非融合型表达载体,操作时都要 注意不能改变外源基因的开放阅读框架。 ,,大肠杆菌是最常用的基因表达系统,由于缺少转录后的加工 系统和翻译后的加工系统,真核基因在大肠杆菌中转录和翻译后 都不能进行加工,使它的应用受到一定的限制。可选择昆虫细胞 和哺乳动物细胞替代大肠杆菌作为表达系统。哺乳动物细胞作 为表达系统具有如下优点: ())重组质粒转染的细胞具有遗传的 稳定性和可重复性;(-)哺乳动物细胞能对外源基因转录的 ./’"#剪切加工成成熟的 &’"#;($)对表达的蛋白质能进行转 录后的加工,如糖基化;(0)可将表达产物分泌到培养基中方便 下游的提纯。 ,,基因工程技术在医药卫生领域中的广泛应用促进了医学的 进步与发展。基因工程疫苗因剔除了致病基因,比传统疫苗安 全,也没有血液制品的潜伏交叉感染的危险。由基因工程技术生 产的生物制剂,如干扰素、白介素、多种细胞生长因子等已经投入 临床使用。基因诊断、基因治疗都离不开基因工程技术。

 

基因工程技术为生命科学和医学研究提供了新 的方法和手段。 第二节 ,分子杂交 ,,分子杂交(&12345267 .897:;:<6=:1/)是基因工程和分子生物学的重要技术之一,也是基因诊断中最常用 的技术。 ,,分子杂交以 !"#的变性和复性为理论基础。 !"#在某些理化因素的作用下碱基对间氢键破坏,由 双链变成单链的过程谓之 !"#变性。变性 !"#的单链重新合成双链的过程为 !"#的复性。分子杂交 是指不同来源的单链核酸通过碱基互补形成杂合双链的过程。其中的一条单链杂交前要进行标记,称为 探针。分子杂交中探针的浓度大于待测核酸的浓度,以保证探针与 !"#充分杂交。 一、核酸探针 ,,核酸探针(>7193)是分子杂交的技术基础,它是一段与被检测的核酸序列互补的带有标记的核苷酸片 段,长度一般为十几到几千个碱基不等。探针标记的方法分为: ,,(一)放射性同位素标记 ,,用于标记核酸探针的同位素主要是 $-?, $-?标记的探针广泛用于各种滤膜杂交,它的放射活性高,能 释放 !粒子,穿透力强,通过放射自显影,灵敏度高,需要时间短,但它半衰期短,标记的探针最好在一周内 图 )* +,基因工程表达的蛋白质电泳图 "!!第三篇 !遗传信息的传递 使用。 !!(二)光敏生物素

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点击次数:  更新时间:2016-11-29 09:32:32  【打印此页】  【关闭